ACTIVIDAD 1 - Obtención de extractos de subproductos de olivo enriquecidos en compuestos bioactivos con actividad antiinflamatoria

Tarea 1.1. Extracción y microencapsulación de compuestos bioactivos de subproductos de olivo

Descripción: Optimización de proceso de extracción de los componentes bioactivos de subproductos de la industria olivarera para la obtención de extractos enriquecidos. Encapsulación del extracto seleccionado obtenido mediante diferentes técnicas con agentes encapsulantes que permitan una liberación controlada y dirigida en colon.

Metodología: En la optimización del proceso de extracción para la obtención de ingredientes funcionales enriquecidos en compuestos bioactivos a partir de subproductos de la industria olivarera, se emplearán técnicas de extracción convencionales en las que se utilizarán diferentes combinaciones de disolventes aceptados en la industria alimentaria. Durante el proceso, se optimizarán los parámetros más influyentes en la eficiencia de extracción, como sontipo de disolvente, temperatura, agitación y tiempo de extracción, entre otros.

Para la microencapsulación de los extractos enriquecidos en compuestos bioactivos se emplearán distintas tecnologías. Por un lado, en la encapsulación mediante atomización spray drying, se optimizarán distintos parámetros experimentales para optimizar el rendimiento del proceso. En este sentido, se evaluará la influenciadel caudal y temperaturas de entrada y salidas del aire de secado, el caudal de alimentación de la muestra, tamaño del orificio del atomizador, caudal de aire de atomización, así como la presión diferencial del ciclón. Adicionalmente, se emplearán distintos agentes encapsulantes que permitan por un lado la encapsulación de los compuestos de interés, así como su liberación controlada en colon. Una vez fijados los parámetros de secado, se optimizará el proceso de encapsulación. La nanoencapsulación de los extractos seleccionados se realizará mediante la utilización de distintos fosfolípidos y otros ingredientes que faciliten la estabilización de los componentes en las vesículas desarrolladas, así como la protección de las mismas a lo largo del tracto gastrointestinal permitiendo su liberación en colon. La aplicación de ultrasonidos será la empleada para desarrollar estas vesículas. Para la elaboración de estas nanopartículas se optimizarán varios parámetros como son la concentración del extracto, fosfolípidos y agentes estabilizantes de estas partículas, así como el tiempo de sonicado para su elaboración. Las vesículas obtenidas serán analizadas para evaluar la eficiencia de encapsulación de los compuestos de interés mediante ambas tecnologías.

Tarea 1.2. Evaluación del potencial antiinflamatorio in vitro de los extractos de subproductos de olivo

Descripción: Evaluación de la capacidad antiinflamatoria de los extractos obtenidos en la Tarea 1.1. mediante ensayos espectrofotométricos. Además, se determinará la capacidad para inhibir las enzimas hialuronidasa y elastasa dado que sus inhibidores modulan múltiples dianas de enfermedades relacionadas con la inflamación.

Metodología: Para la evaluación de la capacidad antiinflamatoria de los extractos de subproductos de olivo se llevarán a cabo una combinación de métodos espectrofotométricos que proporcionen la mayor información posible para la valoración de su potencial bioactivo. Por tanto, se realizarán ensayos de inhibición enzimática para enzimas hialuronidasa y elastasa mediante un kit específico. Las determinaciones se realizarán por triplicado.

Tarea 1.3. Caracterización cualitativa y cuantitativa de la composición de los extractos con mayor potencial bioactivo obtenidos mediante HPLC-MS

Descripción: Análisis de la composición de compuestos bioactivos de los extractos seleccionados en la Tarea 1.2.    

Metodología: Aplicación de métodos analíticos, mediante HPLC-ESI-qTOF-MS y HPLC-ESI-TOF-MS, para la determinación cualitativa y cuantitativa de los compuestos bioactivos presentes en los extractos de subproductos de olivo escogidos de la actividad anterior. Para ello se estudiará la influencia que ejercen los principales parámetros relacionados con la separación cromatográfica (tipo de columna, fases móviles, gradiente de elución, flujo de fase móvil, temperatura de la columna, volumen de muestra inyectada…). Seguidamente, se optimizarán las variables instrumentales asociadas a la ionización y detección en analizadores de masas de tiempo de vuelo, comenzando por el flujo y temperatura de los gases de nebulización y secado, el rango de masas detectado, así como los principales parámetros de transferencia y del tubo de vuelo como los diferentes voltejes y radiofrecuencias. Además, se optimizarán los parámetros de fragmentación, principalmente la energía de colisión para conseguir la confirmación en la identificación de los compuestos mediante su patrón de fragmentación. Una vez optimizadas las condiciones instrumentales idóneas para cada uno de los extractos, estos se analizarán para llevar a cabo la identificación de los compuestos bioactivos presentes, así como su concentración.

Tarea 1.4. Selección de las condiciones óptimas de extracción y microencapsulación para el escalado de la producción

Descripción: Evaluación de las condiciones de extracción, microencapsulación y contenido de compuestos bioactivos en los extractos obtenidos para obtener el extracto/s óptimo/s.    

Metodología: A través de la evaluación de los resultados obtenidos en cuanto a rendimiento de extracción, eficiencia de encapsulación, bioactividad y contenido en compuestos bioactivos de los diferentes extractos obtenidos, y mediante la aplicación de diseños experimentales de superficie de respuesta se seleccionarán las condiciones óptimas de extracción y microencapsulación idóneas para el escalado piloto.

ACTIVIDAD 2 - Escalado piloto de la producción y microencapsulación del ingrediente bioactivo

Tarea 2.1. Extracción a escala piloto de los subproductos de la industria olivarera.

Descripción: Obtención del extracto seleccionado en la actividad 1 a escala preindustrial, escalando las condiciones experimentales optimizadas en laboratorio, adecuando los parámetros instrumentales a los equipos de escala piloto.

Metodología: Para el escalado del proceso de extracción se extrapolarán las condiciones experimentales de temperatura y porcentaje de disolventes empleados en los procesos de extracción a escala laboratorio a maceradores piloto. Previos a la producción preindustrial del extracto seleccionado, se optimizarán distintos parámetros experimentales que son determinantes en el proceso de extracción, como son el caudal de disolvente, el tamaño de partícula de la muestra o el tamaño de poro de los filtros del equipo con el objetivo de aumentar el rendimiento del proceso.

Tarea 2.2. Encapsulación a escala piloto de los subproductos de la industria olivarera.

Descripción: Obtención del extracto encapsulado empleando la técnica seleccionada en la actividad 1 a escala preindustrial.

Metodología: Para la encapsulación a escala piloto del extracto obtenido, se considerarán los resultados obtenidos en la Actividad 1, evaluando la eficiencia de encapsulación, el rendimiento del proceso y el coste económico del proceso, con el objetivo de determinar la técnica de encapsulación viable para la producción del ingrediente funcional a escala industrial.

ACTIVIDAD 3 - Obtención del ingrediente bioactivo a escala industrial

Descripción: Obtención del extracto seleccionado en la actividad 2 a escala industrial, al objeto de disponer de un producto representativo y reproducible para ser utilizado en los estudios de funcionalidad posteriores. En esta etapa se produce la validación industrial de la etapa de escalado piloto.

Metodología: A partir de la información y datos operacionales obtenidos en la fase de planta piloto de la actividad anterior, se elaborará toda la documentación técnica y estudios necesarios para la realización de un lote de demostración industrial. Para ello se parte de la reproducción del proceso completo de extracción y purificación del extracto en el laboratorio de I+D de Deretil, aplicando los parámetros esperados en la planta de producción, por su tamaño y configuración, y se comprueba que las especificaciones del proyecto se mantienen o se reajustan, según sea procedente.

Se implementarán los análisis y controles requeridos en el proceso, para llevar a cabo el control de la producción, y se preparará toda la documentación técnica requerida de seguridad y calidad:

  • Análisis de tareas, análisis de seguridad del proceso y HAZOP.
  • Elaboración de ficha técnica del producto según normativa.
  • Revisión del APPCC.
  • Revisión del Plan General de Higiene de la Planta de fabricación de extractos.
  • Formación del personal de fabricación.

ACTIVIDAD 4 - Formulación de un nutracéutico a partir del ingrediente bioactivo de olivo obtenido a escala industrial

Descripción: Se realizará la formulación del ingrediente bioactivo obtenido a escala industrial a partir de los subproductos de olivo en formato nutracéutico de cápsulas duras. 

Metodología:El desarrollo de cápsulas duras, implica realizar un estudio previo de 1) pre-formulación con el ingrediente bioactivo, y determinar si irá acompañado de algún/os coadyuvante/s (o excipiente/s) para favorecer su elaboración a nivel tecnológico, y evaluar sus propiedades de flujo; estudio de 2) formulación y estabilidad de los ingredientes (extracto seco bioactivo y coadyuvantes) adaptados en la forma de dosificación elegida bajo unos parámetros fisicoquímicos de almacenamiento determinados (tiempo, temperatura y humedad); 3) optimización de la formulación final en base a los resultados obtenidos para llevar a cabo su elaboración tras observar el comportamiento del producto en los equipos; y realización de 4) ensayos de control de calidad específicos para las formas de dosificación elegidas.Una cápsula duraestá compuesta de dos partes: cabeza o tapadera y cuerpo o base, las cuales se ensamblan por deslizamiento de una parte con la otra provocando el cierre hermético que da lugar a la forma de dosificación (farmacéutica, galénica o también llamada de administración). En el interior de la cápsula irán los ingredientes (o materias primas), compuestos activos y coadyuvantes (o excipientes).

ACTIVIDAD 5 - Desarrollo de una aplicación móvil para el seguimiento de los sujetos del ensayo de intervención nutricional

La aplicación móvil que permitirá realizar el seguimiento de cada voluntario contará con las siguientes funcionalidades:

  • Cuestionario interactivo con diseño gráfico amigable e interfaz intuitiva que recoja del paciente los valores de las variables a analizar en el marco del estudio.
  • Sistema de alarmas con disparadores (inteligencia artificial) sobre cotas de interés en las variables a monitorizar, en función de si se alcanzan ciertos valores preestablecidos o de si la alteración de la variable tiene una frecuencia alta en el conjunto de usuarios.
  • Mecanismos de privacidad y seguridad, de manera que se garantice la integridad en el proceso de transmisión de información entre la aplicación y el centro de control del proyecto.
  • Herramientas de gamificación para fomentar la motivación en el proceso interactivo del paciente, prestando especial atención al tramo de mayor edad. Se seguirán tres enfoques: competitivo (todos contra todos), colaborativo (todos por el bien común), y mixto (competitivo por equipos que colaboran de forma interna para lograr un bien común), teniendo en consideración que el hecho de interaccionar con los demás voluntarios es un elemento motivador.
  • Sistemas de comunicación directa y en tiempo real entre el usuario y el centro de control, para las casuísticas que así lo requieran.

Tarea 5.1. Definición de variables a registrar a través de la aplicación móvil

Descripción: En cuanto al conjunto de variables cuyos valores serán recogidos en la aplicación móvil de seguimiento, su definición se realizará en función de los requerimientos del ensayo detectados como resultado de la revisión bibliográfica y de las necesidades de análisis detectadas. Estas variables recogerán información sobre el estado general del voluntario y serán tanto objetivas (estado general o sensación intestinal, entre otras) como no objetivas (por ejemplo, relativas a la tensión arterial). De este modo, esta tarea se realizará de manera conjunta con la UGR.

Tarea 5.2. Análisis y definición de requerimientos técnicos

Descripción: Definición de los requisitos funcionales de la aplicación de seguimiento. Se establecerán igualmente las particularidades en cuanto a privacidad y seguridad que se deben cumplir, al igual que las propias de distribución y sistema operativo en el que se ejecutará la cumplir, al igual que las propias de distribución y sistema operativo en el que se ejecutará la aplicación. Concretamente, la aplicación móvil será desarrollada para Android de Google e iOS de Apple, por ser los sistemas operativos más extendidos del mercado de teléfonos inteligentes. Como resultado obtendremos una serie de “casos de uso” o funcionalidades aplicadas, y el comportamiento esperado de las mismas.

Tarea 5.3. Diseño gráfico de la aplicación móvil

Descripción: Diseño gráfico del marco o interfaz de usuario, para lo que se realizará el grafismo asociado a las distintas funcionalidades ya descritas que mejor se adapte al uso de la aplicación final, persiguiendo conseguir una interfaz amigable e intuitiva.

Tarea 5.4. Desarrollo software de la aplicación móvil

Descripción: Definición y construcción de la arquitectura tecnológica del sistema, sobre la que se apoyará el funcionamiento de la aplicación, para cada una de las funcionalidades que debe integrar, a partir de las especificaciones establecidas en las tareas que anteceden a ésta. El modelo se desarrollará para ambos sistemas operativos considerados, Android e iOS.

Tarea 5.5. Validación y verificación tecnológica

Descripción: Validación funcional de la aplicación, verificando la correcta implementación de los requerimientos del sistema para determinar si existen defectos en su funcionamiento. Se comprobará igualmente la correcta interacción de los componentes integrados y la comunicación con el servidor central al que se transfieren los datos. La realización de las pruebas funcionales oportunas permitirá detectar los posibles problemas, que serán revisados y solucionados antes de proceder a su publicación.

Tarea 5.6. Subida de la aplicación a los marketplaces de Google y Apple

Descripción: Publicación de la aplicación móvil en las tiendas virtuales de los sistemas operativos Android e iOS, Google Play Store y Apple App Store, respectivamente. De este modo, la aplicación podrá ser descargada para su uso, por los voluntarios que participarán en el estudio de investigación planteado en este proyecto.

Metodología: El desarrollo de software es una tarea compleja que requiere una adecuada coordinación en el equipo. El correcto desarrollo de las tareas que componen esta actividad resultará de emplear la metodología ágil de desarrollo Scrum, lo que permitirá minimizar riesgos a través de prácticas colaborativas. Esta metodología ágil tiene un enfoque de mejora continua que asegura que el producto terminado cumple con los criterios de aceptación, logrando el valor esperado y los niveles de calidad requeridos.

Está basada en sprints (o iteraciones), con duración de 2-4 semanas cada uno, en las que es posible realizar modificaciones sobre el Sprint backlog (lista de requerimientos) y añadir nuevas tareas. Según el sprint, puede haber un entregable a final de plazo o tener un flujo constante de trabajo realizado durante el periodo del sprint. Se tienen en cuenta conceptos como Work in Progress, o limitación de la capacidad del equipo.

Antes del inicio del sprint se realizará una reunión formal de preparación del mismo. En base a ésta se define el ámbito del siguiente sprint y la “definición de hecho” para las tareas incluidas, lo que permitirá un flujo constante en la entrega de trabajo, como se indicaba previamente. A diario se realizará una reunión breve con el equipo para medir progresos, resolver barreras o problemas, etc. Al final de cada sprint tendrá lugar una reunión de retrospectiva.

Por lo tanto, todos los sprints tendrán normalmente la siguiente estructura y procedimiento:

  • Reunión inicial con objeto de estudiar todos los informes y análisis para generar tareas que irán al backlog o lista de requerimientos. Se priorizan tareas y quedan enmarcadas en el siguiente sprint.
  • Reuniones diarias para el desarrollo de las tareas incluidas en el sprint, en las que es posible añadir tareas urgentes. Cada tarea puede ser finalizada antes del fin del sprint (su definición incluirá, si procede, las pruebas y validaciones necesarias).
  • Reunión final al término del sprint como evaluación e identificación de mejoras en el proceso.

El proyecto contará con un número indefinido de sprints hasta que se alcancen los objetivos tecnológicos definidos para el mismo, en los que participarán los socios del proyecto en la fase de validación de los resultados.

ACTIVIDAD 6 - Estudio de intervención nutricional

Tarea 6.1. Diseño del estudio de intervención nutricional longitudinal

Descripción: Reclutamiento de los voluntarios para el estudio de intervención nutricional y establecimiento de las condiciones a los voluntarios para la recolección de las muestras biológicas adecuadas de cara a resolver la hipótesis del proyecto.

Metodología: El estudio de intervención nutricional se registrará en http://www.clinicaltrials.gov y se realizará siguiendo los principios éticos reflejados en la Declaración de Helsinki (“World Medical Association Declaration of Helsinki,” JAMA 310, no. 20 (November 27, 2013): 2191, https://doi.org/10.1001/jama.2013.281053.). En esta actividad, se reclutarán 50 voluntarios (25 hombres y 25 mujeres) necesarios para llevar a cabo el estudio. Los participantes serán seleccionados de acuerdo a los criterios de inclusión y exclusión definidos para este proyecto (descripción a continuación). El reclutamiento de voluntarios se llevará a cabo mediante anuncios y carteles en facultades, centros deportivos, centros médicos, ayuntamientos, páginas web, redes sociales, etc. Las personas interesadas serán convocadas a una reunión donde se les informará por escrito de toda la información acerca del proyecto y tendrán la posibilidad de preguntar todas sus dudas. Además, se les facilitará el acceso a la aplicación móvil desarrollada para su seguimiento, así como la información necesaria para que puedan registrar la información pertinente durante la realización del ensayo. Una vez superada la selección, los participantes firmarán el Consentimiento Informado del Estudio. Todos los datos recogidos de los participantes serán gestionados atendiendo a la Ley de Protección de Datos Personales y garantía de los derechos digitales 3/2018 («BOE» núm. 294, de 6 de diciembre de 2018). En caso de que el número de voluntarios que no mantengan su compromiso con el proyecto durante el desarrollo del estudio de intervención o que cumplan algún criterio de exclusión una vez iniciado el estudio, como plan de contingencia se reclutarán nuevos voluntarios. No obstante, se ha elegido un número significativo de voluntarios (50) para obtener conclusiones reproducibles incluso en el caso de obtener la pérdida del 25% de los voluntarios. Los criterios de inclusión y exclusión de los sujetos son los siguientes:

  • Ser hombres o mujeres sanos, de edad comprendida entre 45 y 65 años.
  • No padecer ninguna patología crónica ni estar sometido a tratamientos farmacológicos prolongados.
  • No ser vegetarianos/veganos.
  • No ser fumadores.
  • No presentar un índice de masa corporal (IMC) mayor a 25 kg/m2.
  • No ser consumidores de suplementos alimenticios similares a los del estudio.

Tarea 6.2. Desarrollo del estudio de intervención nutricional longitudinal en los voluntarios seleccionados

Descripción: Ingesta del suplemento alimenticio basado en el ingrediente bioactivo de olivo desarrollado por parte de los voluntarios y recolección de muestras biológicas a lo largo del estudio de intervención nutricional longitudinal.

Metodología: El estudio planteado será de carácter doble ciego, aleatorizado y controlado con cápsulas placebo. 40 voluntarios consumirán diariamente el suplemento en forma de cápsula con el ingrediente funcional de olivo en una dosis de 500 mg, mientras que 10 sujetos consumirán cápsulas placebo sin el ingrediente funcional. La Figura 2 muestra esquemáticamente el período en el que los voluntarios consumirán el suplemento alimenticio de subproductos de olivo o cápsulas placebo de acuerdo al grupo asignado de manera aleatoria (entre los meses 6 y 8). Durante estos dos meses y en los meses previos y posteriores a este período de consumo, se recolectarán muestras de sangre, orina, heces y saliva para estudiar el efecto biológico producido por el consumo del suplemento, además de observar, por una parte, la variabilidad intra-individuo y así poder confirmar que los cambios son debidos a la ingesta del suplemento, y, por otra parte, si el efecto del tratamiento es estable durante el tiempo.

Tarea 6.3. Pre-tratamiento y conservación de muestras biológicas

Descripción: Pre-tratamiento de las muestras biológicas tras la recolección de las mismas y su correcta conservación.

Metodología: Las muestras de sangre serán recolectadas en tubos Vacutainer con anticoagulante K2EDTA para su posterior centrifugación (15 min, 3000 g, 4°C) y obtención de las correspondientes muestras de plasma sanguíneo. Por otra parte, se aislarán la fracción de células mononucleares de sangre periférica (PBMC). Para ello tras la etapa de centrifugación, la capa celular se recogerá y se lavará dos veces con solución salina tamponada con fosfato estéril con centrifugación a 300 g durante 10 minutos entre cada etapa de lavado. Las muestras de orina serán centrifugadas (4000 g, 20 min, 4°C), y serán conservadas tanto el sobrenadante como el pellet, por separado. Las muestras de plasma sanguíneo y de orina obtenidas tras la etapa de pre-tratamiento así como las muestras de heces recogidas en tubos con perlas de vidrio, y de saliva serán conservadas a una temperatura de -80 °C para la correcta conservación de todos sus componentes.

ACTIVIDAD 7 - Efecto sobre metabolismo endógeno del consumo del suplemento nutricional formulado a partir del ingrediente bioactivo de olivo

Tarea 7.1. Análisis de las muestras plasmáticas mediante estrategias metabolómicas no dirigidas

Descripción: Tratamiento y análisis de las muestras de plasma recolectadas en el estudio de intervención para su análisis mediante técnicas separativas (cromatografía de líquidos) acopladas a espectrometría de masas de alta resolución para estudiar los cambios metabólicos producidos por el consumo del suplemento desarrollado en actividades anteriores.

Metodología: Las muestras serán analizadas usando estrategias metabolómicas no dirigidas mediante plataformas analíticas basadas en espectrometría de masas con el fin de lograr la mayor cobertura del metaboloma endógeno. Debido a la naturaleza de las muestras a analizar, plasma sanguíneo, y de la plataforma analítica a utilizar, dichas muestras serán previamente sometidas a diferentes etapas de tratamiento (precipitación de proteínas y/o pre-concentración) para su correcta adecuación al análisismetabolómico. 

Tarea 7.2. Procesamiento y análisis estadísticos de los datos obtenidos para la identificación de las señales debidas a la ingesta del suplemento

Descripción: El procesamiento de datos tiene como propósito reducir la complejidad de los datos adquiridos (eliminación del ruido, corrección de la línea base, etc.), la extracción de las señales detectadas, así como la transformación de datos para su tratamiento estadístico posterior. Por consiguiente, los análisis estadísticos mostrarán aquellos metabolitos que se vieron afectados (tanto incrementando como disminuyendo su concentración) tras la ingesta del suplemento de subproductos de olivo. Además, a cada metabolito se le asignará, en la medida de lo posible, un rol positivo o negativo para la salud humana y su potencial relación con la inflamación.

Metodología: Uso de herramientas de procesamiento de datos para la detección y deconvolución de las señales, alineamiento (tiempos de retención y m/z), normalización, agrupación de señales y tratamiento de datos para adecuar la matriz a los análisis estadísticos. Estas herramientas serán seleccionadas de manera acorde a la plataforma analítica utilizada (HPLC-MS). Empleo de diferentes análisis estadísticos univariantes (t-student, ANOVA,…) y multivariantes (PCA, PLS, RandomForest, análisis jerárquico de grupos, etc.) para la identificación de las señales que muestran efectos estadísticamente significativos producidos por el consumo de suplemento basado en el estudio de intervención nutricional.

Tarea 7.3. Identificación e interpretación biológica de los metabolitos alterados por la ingesta del suplemento

Descripción: Asignación de la estructura química a las señales que resultaron estadísticamente significativas en la tarea anterior. Interpretación biológica a partir de los metabolitos identificados para entender las rutas metabólicas afectadas por el consumo del suplemento de olivo.

Metodología: Realización de análisis de masas en tándem (MS/MS). Utilización de la información de las señales obtenidas por espectrometría de masas (MS, MS/MS) para su comparación con diferentes bases de datos de metabolómica (HMDB, KEGG, LipidMaps, MassBank, Metlin) así como de herramientas de fragmentación in silico (MetFrag, Sirius, etc.) para la asignación de estructuras químicas a dichas señales de interés. Interpretación biológica de los resultados mediante la utilización de bases de datos, así como herramientas para la evaluación de las rutas metabólicas alteradas significativamente en función de los resultados obtenidos (análisis de enriquecimiento para un grupo de metabolitos, análisis de rutas metabólicas, análisis de sobrerrepresentación).

ACTIVIDAD 8 - Estudios epigenéticos por el consumo prolongado del suplemento alimenticio basado en subproductos de olivo.

Descripción: Determinación de la metilación e hidroximetilación global del ADN de leucocitos de sangre periférica mediante UPLC–MS/MS.

Metodología: En primer lugar, se llevará a cabo la extracción del ADN de la fracción de leucocitos de sangre periférica mediante el método propuesto por Rosella et al. (2009)[1]. Seguidamente, se llevará a cabo la optimización de los diferentes parámetros relacionados con la separación cromatográfica y optimizarán las variables instrumentales asociadas a la detección mediante el MS/MS seleccionados. Una vez optimizadas las condiciones instrumentales idóneas se realizará el análisis mediante UPLC–MS/MS del ratio entre 5-metil-2′-desoxicitidina y 2′-desoxiguanosina o de 5-hidroximetil-2′-desoxicitidina y 2′-desoxiguanosina para determinar los niveles de metilación e hidroximetilación globales en el ADN siguiendo el método propuesto por Wang et al. (2011) (Federica Rossella et al., “Development and Validation of a Gas Chromatography/Mass Spectrometry Method for the Assessment of Genomic DNA Methylation,” Rapid Communications in Mass Spectrometry 23, no. 17 (September 15, 2009): 2637–46, https://doi.org/10.1002/rcm.4166.).

ACTIVIDAD 9 - Influencia del suplemento de subproductos de olivo en la microbiota humana.

Tarea 9.1. Análisis de las muestras para la identificación de bacterias, hongos y levaduras en saliva, heces y orina

Descripción: En total se va a extraer el ADN de un total de 1200 muestras, como resultado de la suma de ocho tiempos de muestreo (Figura 2), 50 participantes (40 con ingesta de suplemento de hoja de olivo y 10 con ingesta de placebo) y tres regiones de muestreo (saliva, heces y orina).

Metodología: Los protocolos de extracción de ADN en saliva, heces y orina están perfectamente establecidos. Resumidamente, los microorganismos contenidos en 1 ml de saliva, en el pellet procedente de la centrifugación de 10 ml de orina y los procedentes de 100 mg de heces, respectivamente, se lisarán mediante lisis mecánica (FastPrep) y el ADN obtenido se re-suspenderá en agua para su posterior amplificación del ADN mediante PCR. La amplificación del ADN en el caso de bacterias se realizará en la región V1-V2 del gen ribosomal 16S (1440 amplificaciones por PCR) y en el caso de hongos y levaduras se realizará en la región ITS (1200 amplificaciones por PCR). A continuación, se elaborarán las librerías para secuenciación en la plataforma MiSeq mediante otra PCR anidada a la anterior en la que se insertarán los “barcodes” para realizar en el último paso el agrupado de todas las muestras. En total se necesitarán cuatro carreras completas de MiSeq (cada carrera con 720 muestras).

Tarea 9.2. Análisis bioinformático y taxonómico de los datos obtenidos por secuenciación masiva

Descripción: Cuantificación relativa de las comunidades de bacterias, hongos y levaduras en cada una de las 1200 muestras.

Metodología: Los ficheros fastQ, dos ficheros por muestra, obtenidos en la tarea anterior serán analizados bioinformáticamente usando el programa R y el paquete dada2. La anotación taxonómica tanto de bacterias como de hongos se realizará en plataformas online gratuitas, en concreto ribosomal data project del centro para ecología microbiana de la Universidad estatal de Michigan (EEUU).

Tarea 9.3. Identificación de las bacterias, hongos y levaduras afectadas por la ingesta del suplemento nutricional de los subproductos de olivo

Descripción: Análisis estadístico de los datos, una vez hecha la anotación taxonómica, con el objetivo de encontrar aquellos taxones influenciados por la ingesta del suplemento nutricional de olivo desarrollado.

Metodología: Se llevarán a cabo tres análisis estadísticos tanto para bacterias como para hongos y levaduras, tratados en el primer procedimiento y en el segundo por separado y juntos en el tercer análisis.

El primer análisis perseguirá hacer un estudio personalizado de cada uno de los 60 voluntarios (tanto para muestras de saliva, orina y muestras fecales) con el objetivo de encontrar aquellos taxones que se ven afectados por la ingesta del suplemento de subproductos de olivo. Para realizar dicho análisis, se observará las tendencias de cada uno de los 500-600 filotipos que se esperan encontrar en cada paciente (Riccardo Vasapolli et al., “Analysis of Transcriptionally Active Bacteria Throughout the Gastrointestinal Tract of Healthy Individuals,” Gastroenterology 157, no. 4 (October 2019): 1081-1092.e3, https://doi.org/10.1053/j.gastro.2019.05.068.) usando el test estadístico de Mann-Witney con la corrección de errores de Benjamini–Hochberg (FDR: false discoveryrate).

El segundo análisis perseguirá la obtención de taxones que se ven afectados en el conjunto global de los voluntarios que han ingerido el suplemento de hoja de olivo, comparado con los voluntarios que han ingerido placebo. Para ello se realizará el Kluskal-Wallis con la corrección de errores de Benjamini–Hochberg (FDR) con cada uno de los 13000 filotipos que se esperan obtener de todo el grupo de voluntarios.

Por último, el tercer análisis estadístico perseguirá encontrar el nexo entre las comunidades bacterianas, hongos y levaduras que conjuntamente se ven afectadas por la ingesta del suplemento de olivo. Para ello se obtendrá el índice de correlación de Spearman de todos los 13.000 filotipos y se elaborará un “Community Network”.

ACTIVIDAD 10 - Integración bioinformática de datos de la aplicación móvil y resultados obtenidos por los diferentes enfoques –ómicos.

Tarea 10.1. Integración holística de datos y resultados

Descripción:Empaquetado y transferencia de la información de los sujetos recopilada en la aplicación durante la ejecución del ensayo e integración de los datos obtenidos por las diferentes –ómicas en una única base de datos bioinformática. En esta base de datos también se incluirán todos los datos relacionados con los voluntarios como por ejemplo la edad, el sexo, BMI, etc. Interpretación de los resultados obtenidos de la aplicación móvil y en los diferentes estudios –ómicos derivados de la intervención nutricional desde un punto de vista global.La integración de los datos provenientes de las distintas –ómicas supondrá una poderosa herramienta para la reconstrucción y el análisis de las complejas interacciones multidimensionales que ocurren en el organismo debidas al consumo del suplemento nutricional de olivo.

Metodología: Búsqueda de bibliografía para la interpretación biológica de los resultados obtenidos tras la ensayo de intervención nutricional desde un punto de vista global. Creación de un servidor online que permita la agrupación de todos los datos y resultados obtenidos.

Tarea 10.2. Análisis estadísticos entre los datos obtenidos por las diferentes -ómicas

Descripción: Análisis estadísticos para la identificación de variables (metabolitos, bacterias, hongos, etc.) que estén altamente correlacionadas entre ellas. Explicación de los resultados biológicos de interés obtenidos.

Metodología: Adaptación de los datos obtenidos por las diferentes -ómicas para la aplicación de posteriores análisis estadísticos (reducción de la dimensionalidad, tratamiento de valores faltantes, etc.). Empleo de aproximaciones multivariantes: regresión de mínimos cuadrados parciales (PLS), análisis de correlación canónica (CCA), análisis de componentes principales (PCA), aprendizaje automatizado (machine learning). Se utilizarán también metodologías de validación para garantizar la calidad de los resultados obtenidos en los análisis estadísticos. Los datos serán analizados bioinformáticamente usando el paquete mixOmics desarrollado en R así como el servidor PGMRA desarrollado por investigadores de la Universidad de Granada.